今天帶大家走入核酸檢測(cè)的常用方法PCR方法，以及如何在PCR檢測(cè)過(guò)程中降低檢測(cè)結(jié)果假陰性概率。

一、什么是PCR技術(shù)?

PCR技術(shù)又稱(chēng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。是一種放大DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，PCR最大的特點(diǎn)是能夠?qū)⑽⒘康腄NA進(jìn)行大幅度的放大，方便進(jìn)行觀察其反應(yīng)。

在今年流行的新冠病毒中核酸檢測(cè)被定義為臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，RT-PCR技術(shù)被反復(fù)提到，它是一種將RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR相結(jié)合的技術(shù)。首先在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將提取到的RNA合成cDNA,再以cDNA為模板，在DNA聚合酶作用下不斷擴(kuò)增(變性-退火-延伸多個(gè)循環(huán))合成目的片段并進(jìn)行分析。

二、PCR用水

PCR技術(shù)目前多搭配試劑盒使用，也有用戶自行制備反應(yīng)體系，無(wú)論哪個(gè)過(guò)程都需要使用水。無(wú)論是近年來(lái)季節(jié)性爆發(fā)的甲流乙流，還是目前都在經(jīng)歷的病毒，在檢測(cè)過(guò)程中都涉及一個(gè)痛點(diǎn)，那就是如何盡可能提高核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性，減少假陰性結(jié)果出現(xiàn)的可能性。

我們首先分析一下假陰性結(jié)果出現(xiàn)的原因，以病毒核酸檢測(cè)為例，假陰性的主要原因有:

1、病人病程:不同病程，患者體內(nèi)病毒載量不同;

2、采樣部位:咽拭子、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等不同采樣部位病毒載量均不同;

3、采樣準(zhǔn)確性:拭子質(zhì)量，工作人員操作等;

4、試劑盒的質(zhì)量:引物設(shè)計(jì)以及水質(zhì)控制。

為了順利將提取到的RNA反轉(zhuǎn)錄并實(shí)現(xiàn)DNA的成功擴(kuò)增，必須抑制核糖核酸酶(RNases)的降解作用，如果試劑盒用水內(nèi)含RNases，將極有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

三、去除RNases的主要方法

1、高壓滅菌：即便是在180°C下高壓滅菌4h之后，RNases仍保持某些活性，且某些細(xì)菌失活會(huì)釋放更多的RNases;

2、DEPC法(二乙基焦碳酸酯處理法) 利用二乙基焦碳酸酯(DEPC) 處理方法使酶失活是用來(lái)抑制水溶液中RNases活性的常見(jiàn)方法。然而，二乙基焦碳酸酯是一種可疑致癌物，處理須小心：同時(shí)該方法雖然能夠使酶失活，卻無(wú)法將其從水中去除，同時(shí)清除多余的DEPC過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生乙醇，二氧化碳等其他污染物;

3、超濾法:超濾是一種真正能夠從水溶液中清除RNases的方法。

四、超濾膜介紹

超濾膜被大量用于水處理工程。超濾技術(shù)在反滲透預(yù)處理、飲用水處理、中水回用等領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。超濾技術(shù)在酒類(lèi)和飲料的除菌與除濁，藥品的除熱原以及食品及制藥物濃縮過(guò)程中均起到關(guān)鍵作用。

超濾過(guò)濾孔徑和截留分子量的范圍一直以來(lái)定義較為模糊，一般認(rèn)為超濾膜的過(guò)濾孔徑為0.001-0.1微米，截留分子量(Molecular weigh cut-off, MWCO)為1,000-1,000,000 Dalton。嚴(yán)格意義上來(lái)說(shuō)超濾膜的過(guò)濾孔徑為0.001-0.01微米，截留分子量為1,000-300,000 Dalton。若過(guò)濾孔徑大于0.01微米，或截留分子量大于300,000 Dalton的微孔膜就應(yīng)該定義為微濾膜或精濾膜。

一般用于水處理的超濾膜標(biāo)稱(chēng)截留分子量為30,000-300,000 Dalton，而截留分子量為6,000-30,000 Dalton 的超濾膜大多用于物料的分離、濃縮、除菌和除熱源等領(lǐng)域。

五、超純水機(jī)推薦

SYZ-VF實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)具備持續(xù)的水質(zhì)監(jiān)測(cè)功能。這款產(chǎn)品的設(shè)計(jì)緊湊，外觀精美，一體化鑄成工藝，不論是穩(wěn)定性還是設(shè)備本身的剛性都得到了極大的提升，能適用于眾多的實(shí)驗(yàn)室科室選擇，是動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)、基因研究、試管嬰兒等生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室的理想選擇。